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外泌體分離

外泌體是什么? |外泌體分離的方法與差異

 

外泌體是細(xì)胞釋放的微小囊泡,因?yàn)楹猩锓肿尤绲鞍踪|(zhì)和DNA、RNA序列,所以能夠影響周圍細(xì)胞的功能,在細(xì)胞間通訊和疾病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。 透過了解外泌體分離的方法,我們能夠研究細(xì)胞間訊息傳遞的機(jī)制,從而揭示許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。

 

內(nèi)容大綱
什么是外泌體/胞外囊泡?
胞外囊泡之命名與生物起源
分離外泌體的方法與差異
傳統(tǒng)超濾 VS 切向流過濾
外泌體的應(yīng)用
外泌體應(yīng)用影片
 

 


 

什么是胞外囊泡/外泌體?

 

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs) 是由細(xì)胞分泌而形成,是一種無法自行復(fù)制的生物納米球狀脂雙層囊泡結(jié)構(gòu)。 這些囊泡存在于多種生物體液中,如唾液、尿液、血液、血清、腦脊液、乳汁等,也可能出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)液中。
細(xì)胞外囊泡包含多種訊號(hào)因子及生物標(biāo)記,如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì),可作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞、溝通的媒介,調(diào)控生理與病理機(jī)制。 根據(jù)尺寸及生物起源的不同,胞外囊泡可分為外泌體 (exosomes)、微囊泡 (microvesicles, MVs) 及凋亡小體 (apoptotic bodies) 三大類別。




 

胞外囊泡/外泌體之命名與生物起源

 

值得注意的是,由于各種細(xì)胞外囊泡的生物起源難以明確判別,因此國際胞外囊泡協(xié)會(huì)(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)于 MISEV2018指南中,建議改以下列方式命名:

 

不同的外泌體種類命名方式

 

命名依據(jù)

物理特征

表面標(biāo)記

囊泡的狀態(tài)或細(xì)胞起源

外泌體種類范例

?大?。簊mall / medium / large extracellular vesicles (sEVs / mEVs / lEVs)

?密度:low / middle, high EVs

?D63+ / CD81+ EVs

?Annexin A5-stained EVs

?足細(xì)胞 Podocyte EVs

?缺氧性 Hypoxic EVs

?癌小體 Large oncosomes

?凋亡小體 Apoptotic bodies

14官網(wǎng)應(yīng)用圖-外泌體分離_En.jpg

 

外泌體來源

 

相較于脂質(zhì)體、奈米粒子等合成載體,外泌體來源具有內(nèi)源性及異質(zhì)性等特性,使得外泌體可作為優(yōu)良載體,能透過多種途徑和位點(diǎn)將具有生物活性的物質(zhì)運(yùn)送至目標(biāo)細(xì)胞參與調(diào)節(jié),如組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、血管新生、細(xì)胞分化、腫瘤形成等。

因此,外泌體在疾病診斷、*和生物研究方面,具有很大的潛力及優(yōu)勢(shì),如作為腫瘤診斷的生物標(biāo)記、癌病*的藥物載體等。

 

外泌體缺點(diǎn)

 

然而,外泌體也存在著一些限制,如低穩(wěn)定性、低產(chǎn)量、低純度以及弱標(biāo)靶性等因素,都可能會(huì)限制其臨床應(yīng)用。

胞外囊泡 (Extracellular vesicles, EVs)

外泌體 (Exosomes)

微囊泡 (Microvesicles)

凋亡小體 (Apoptotic bodies)

尺寸

40~120 nm

100~1000 nm

1000~5000 nm

生物起源/外泌體來源

多囊體(Multivesicular bodies, MVB),
透過內(nèi)吞途徑 (endo-lysosomal pathway)

細(xì)胞膜 (Plasma membrane),
通過向外出芽 (outward budding)

細(xì)胞膜 (Plasma membrane),
細(xì)胞凋亡 (apoptosis) 過程

 


 

外泌體分離的方法與差異

 

隨著對(duì)外泌體的研究不斷深入,其潛在應(yīng)用價(jià)值也持續(xù)不斷地被發(fā)掘。 外泌體的分離、純化及濃縮(又稱富集,enrichment)對(duì)于評(píng)估其生物學(xué)功能及其下游應(yīng)用至關(guān)重要。

然而,外泌體萃取因生物樣品的成份復(fù)雜,內(nèi)含許多相似的分子結(jié)構(gòu),如細(xì)胞碎片、蛋白聚集體、脂蛋白等,且外泌體的大小、組成具有異質(zhì)性,使得外泌體分離更具有挑戰(zhàn)性。 因此,如何有效地分離與濃縮外泌體是學(xué)術(shù)研究及臨床應(yīng)用中面臨的一大考驗(yàn)。

 

常見的外泌體分離方式比較

 

外泌體分離的方法很多種,依原理不同,常見方法為超速離心法、粒徑篩析層析法、超過濾法、沉淀法和免疫親和法,下表統(tǒng)整了各方法的差異:

 

超速離心法(UC) *1

粒徑篩析層析法( SEC)

超過濾法( UF)

沉淀法

(Precipitation)

免疫親和法 (IA)

分離原理

沉降系數(shù)

(大小、密度)

水動(dòng)力半徑

(大小、分子量)

濾膜孔徑

(大小、分子量)

溶解度 

(表面電荷)

特異性結(jié)合

(膜蛋白標(biāo)記)

產(chǎn)率

純度

(脂蛋白)

中高

(脂蛋白、白蛋白)

(蛋白質(zhì))

(蛋白質(zhì)、聚合物)

功能性 

時(shí)間

> 4 hr

0.3 hr*2

< 4 hr

≈0.3~12 hr

4~20 hr

處理樣品體積

大*(TFF)

EVs變性、失活

是 (高速)

是 (剪切力)

是 (與蛋白質(zhì)或聚合物共沉淀)

是 (沖提步驟)

難易度

適中

簡(jiǎn)單

簡(jiǎn)單

簡(jiǎn)單

適中

擴(kuò)展性

中~高*3(TFF)

其它

?黃金標(biāo)準(zhǔn)

?勞動(dòng)密集、耗時(shí)

?再現(xiàn)性高

?EVs 功能、形態(tài)完整

?再現(xiàn)性高

?使用彈性高

?濾膜堵塞

?聚合物難分離

?Kit 成本高

?EVs 純度*

?特定 EV 亞群研究

?無法分離總 EVs

?抗體成本高

*1超速離心法 (UC)又稱為差速心法 (Differential ultracentrifugation, dUC)
*2使用專業(yè)純化 kit 可于20分鐘內(nèi)完成EVs純化
*3高擴(kuò)展性是指 TFF 切向流過濾法 ( Tangential Flow Filtration)

 


 

傳統(tǒng)超濾與切向流過濾的優(yōu)劣勢(shì)分析

 

超過濾法 (UF) 是以分子大小進(jìn)行分離的方法,其中又可細(xì)分為以離心驅(qū)動(dòng)的超濾離心管、壓力驅(qū)動(dòng)的攪拌式過濾器及切向流過濾 (tangential flow filtration, TFF) 三種類型。
超濾離心管及攪拌式過濾器的作簡(jiǎn)單、處理時(shí)間快,但*的問題是濾膜易堵塞 (clogged),不僅降低分離效率且成本高; 而切向流過濾技術(shù) (TFF) 的發(fā)展則可大幅解決濾膜堵塞的問題。

14官網(wǎng)應(yīng)用圖-外泌體分離_傳統(tǒng)超濾法.jpg

 

TFF切向流過濾技術(shù)用于外泌體分離

 

多篇文獻(xiàn)也指出TFF用于EVs分離時(shí),不論產(chǎn)量、再現(xiàn)性、去污染能力都比稱為EV純化的黃金標(biāo)準(zhǔn)的超速離心法(UC or dUC)來得*,甚至節(jié)省了40%以上的時(shí)間,更適合大規(guī)格量產(chǎn)的應(yīng)用。
各方法的詳細(xì)比較及TFF &UC的EV分離數(shù)據(jù),可觀看'EXOSOME外泌體純化在線研討會(huì)直播精華'。

盡管現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出各種外泌體分離方法,但這些方法仍存在缺點(diǎn),無法完全滿足分離外泌體的高純度及高產(chǎn)率需求。 為了提高外泌體的分離效率和濃縮程度,許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開始嘗試結(jié)合多種分離方法; 截至目前,已有研究指出,多種分離方法比單一分離方法能更有效地提高產(chǎn)量和純度。 例如,結(jié)合 UC 和 UF 初步萃取外泌體,再利用 IA 進(jìn)一步純化目標(biāo)外泌體。 或者可以結(jié)合 UC 和 SEC,不僅可以處理大體積樣品,還可以有效減少污染物的干擾。 在選用結(jié)合方法時(shí),應(yīng)注意各別單一方法對(duì)目標(biāo)外泌體是否會(huì)造成不良影響,如外泌體變性、失活等問題。 以下為 TFF 搭配各種技術(shù)進(jìn)行外泌體的分離方法。

 

目標(biāo)

EV 處理方法

TFF 功用

孔徑

品牌

樣品來源

純化

濃縮

置換buffer

1

Exosome

TFF → SEC

V

V

 

5 nm

HansaBioMed,

TFF-Easy

細(xì)胞培養(yǎng)液 (DP-MSC)

2

EVs

TFF → SEC

V

V

 

50 ± 10 nm

HansaBioMed,

TFF-EVs

HPL 上清液

3

Exosome

UC → TFF

 

V

 

5 nm

HansaBioMed,

TFF-Easy

細(xì)胞培養(yǎng)液 (NK-92 cell)

4

Plant EVs

dUC → TFF

 

V

 

5 nm

HansaBioMed,

TFF-Easy

細(xì)胞培養(yǎng)液 (煙草)

5

Exosome

(TFF) → Qiagen, exoEasy Maxi Kit / SEC

 

V

(10~20X)

 

5 nm

HansaBioMed,

TFF-Easy

細(xì)胞培養(yǎng)液 (cancer cells)

6

Exosome

LSC* (300g) → TFF╳

V

V

 

100 kDa

Pall, Minimate

細(xì)胞培養(yǎng)液 (EF-MSCs)

7

EVs

LSC* (300g) → TFF

V

V
(50X)

 

300 kDa

Pall, Minimate

細(xì)胞培養(yǎng)液 (ASC)

8

EVs

TFF

V

V
(4~20X)

V

0.65 μm, 500 kDa

Spectrum Labs

細(xì)胞培養(yǎng)液

脂肪抽吸液 (Lipoaspirate)

*LSC:Low speed centrifugation,低速離心法

Klimova, D. et al., 2023

Kenneth W. Witwer, 2022

Kim et al., 2022

Eric With, et al., 2021

Altanerova, U. et al., 2021

Sung et al., 2021

Lee et al., 2021

Busatto, S. et al., 2018

 


 

外泌體的應(yīng)用

 

  • 疾病診斷/預(yù)后:作為生物標(biāo)記用于精準(zhǔn)醫(yī)療及預(yù)測(cè)病程,如阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、自體免疫疾病、神經(jīng)退化性疾病、癌癥等
  • 疾病* :分子藥物、*劑、藥物載體及傳遞用于癌癥*及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域
  • 生物研究:DNA、miRNA 等,了解各疾病的生理及病理機(jī)制

 



 

參考文獻(xiàn):

  • A Review of Exosomal Isolation Methods: Is Size Exclusion Chromatography the Best Option, Sidhom et al., International Journal of Molecular Science, 2020
  • Biological Functions Driven by mRNAs Carried by Extracellular Vesicles in Cancer, Prieto-Vila et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021
  • Exosome: A Review of Its Classification, Isolation Techniques, Storage, Diagnostic and Targeted Therapy Applications, Zhang et al., International Journal of Nanomedicine, 2020
  • Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods, Stam et al., Journal of Chromatography B, 2021
  • Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018)-a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, Journal of Extracellular Vesicles, 2018
  • Multiplexed strategies toward clinical translation of extracellular vesicles, Song et al., Theranostics, 2022
  • Progress in Exosome Isolation Techniques, Li et al., Theranostics, 2017
  • Review on Strategies and Technologies for Exosome Isolation and Purification, Chen et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022

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